试验方法丨医疗器械——无菌通行证：安全与质量的双重保障

无菌检查法（Sterility tests）

顾名思义就是检查是否无菌，系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。凡直接进入人体血液循环系统、植入或埋入肌肉、皮下组织、与创伤部位接触的产品、材料或器械，以及医学使用上要求无菌的品种都属于药典要求无菌的产品，可以按本法进行无菌检查。

无菌检查法是为检测无菌工艺产品和终端灭菌产品的无菌性而建立，在药典规定的培养条件下检查活的可培养微生物的一种定性检查方法。由于微生物污染分布的不均匀性，特别是微生物污染率较低时，无菌检查的结论具有一定的局限性。产品的无菌性取决于生产全过程中良好的无菌保证体系、经验证的有效灭菌工艺和遵照《药品生产质量管理规范》的要求管理，并严格执行产品在储存、运输、使用等环节中的防污染措施。所以，供试品若符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

认识无菌检查法

除了培养基制备、储存和稀释液、冲洗液配制等准备工作，无菌检查法实际包含3个部分的实验，分别为：培养基适用性检查、方法适用性试验和供试品的无菌检查。

培养基适用性检查：主要目的有两个，一是确认使用的培养基本身是无菌的，即无菌性检查，通过在适宜温度下放置培养基观察判定；二是确认使用的培养基细菌或真菌是可以舒舒服服生长并且在规定时间内可以被观察到，即灵敏性检查，通过接种特定菌种，观察菌生长状态判断。进行了以上实验，就可以判断检测不到细菌真菌，不是培养基自身造成的。

方法适用性试验：主要目的是判断采用的方法，薄膜过滤法或者直接接种法，是否适用于你要检测的这种产品。尤其是一些产品，本身就含有抑菌成分，这种情况下难道在整个检验期内结果呈现阴性，就是真的无菌了吗？答案是不一定的，因此我们需要排除检验过程中操作或者产品本身的抑菌性。当一个新产品进行无菌试验或者实验条件改变时，需要进行验证试验，可与供试品无菌检查同步进行。

供试品的无菌检查：这就是实打实的对于产品的无菌检测，从检测数量、检验量、阴/阳性对照、接种要求、培养观察和结果判读全都进行了细致规定。谈谈检测数量和检验量，检测数量是一批次一定数量的产品中需要抽检的数量，检验量是每瓶/支中要取多少体积的供试品用于检测。对于检测数量和检测量的规定更好更全面地评估了整批样品的无菌性。

无菌检查要求

（1）无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

（2）单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

（3）日常检验需对试验环境进行监测。

注：“受控环境”主要的关注指标应该是悬浮粒子、浮游菌和沉降菌受控，其他如压差、温湿度等的指标和监测频度也应满足《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》的要求。

培养基的制备及培养条件

（1）培养基可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

（2）制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25°C 、避光的环境下保存，并在经验证的保存期内使用。

注：新版药典将“成品培养基”调整为“商品化的预制培养基”。新版药典不再强调“非密闭-三周”、“密闭-一年”的规定，便于企业实践掌握；但企业应最好具备稳定的验证过程和结果，以支持封闭条件和保存周期。

培养基的适用性检查

无菌性检查每批培养基一般随机取不少于5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养14 天， 应无菌生长。

注：应考虑实践中用于无菌性检查培养的试管装灭菌培养基与无菌检验用的三角瓶装培养基在灭菌方法验证时的两种包装的温度、F0等结果。

（上图为 试验常用金黄色葡萄球菌）

菌种

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认， 以保证试验菌株的生物学特性。

对于不同来源的菌株，国家药典委在2018年ICH Q4药典相关检测方法专题研讨会给出的协调建议是“基本一致，可以协调，不同来源菌株一致性需进行验证”。中国药典<9203>药品微生物实验室质量管理原则中也谈到“标准菌株应来自认可的国内或国外菌种保藏机构”，<1101>中却并没有提及可以使用等效菌株代替。而美国药典<71>里也并未提及同<61>“equivalent strains”。

如何判断不同的编号和机构的同一种菌具有等效性呢？如何开展相关的验证实验？这一点其实没有明确的定论。

无菌检查方法

直接接种法：

薄膜过滤法：

薄膜过滤法一般采用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，对水溶性液体供试品、水溶性固体和半固体供试品、非水溶性供试品、可溶于十四烷酸异丙醇的膏剂和黏性油剂供试品、无菌气雾剂供试品、装有药物的注射器供试品、具有导管的医疗器械（输血、输液袋等）供试品等多种特性试样进行无菌检查。

美国药典章节USP<71>，欧洲药典2.6.1以及中国药典相关章节都明确规定“只要产品性质允许，就必须使用薄膜过滤法”。

膜过滤法的优势：膜过滤有助于对大体积样品实施检测，消除或至少能够减少具有抗菌特性的化合物的存在，并且可确保缓慢生长微生物的恢复。通过以保持生长为基础，该方法还可确保仅检测到活微生物，且结果可靠。这避免了对背景或噪声的过度关注，从而减少这些因素导致的误报。

如果无菌检测出现假阳性结果，需进行彻底的根本原因分析：

A、是否存在抗菌物质导致检测结果出现假阳性。B、检测期间引入的污染所致

处理方法：对流程的每一步重新检查，以确定失败原因。在重复检测之前，必须执行纠正措施。如果样品不合格，则整个批次都视为被污染，且必须销毁该批次。为了避免这种耗时且成本高昂的延迟放行，在受控环境中进行的无菌检测，这与无菌生产中采用的环境类似。近年来，越来越多的人采用隔离器等屏障技术进行无菌检测。

判定标准

（1）当测试结果中，供试品管/组澄清且无菌生长，阳性对照管/组浑浊且有菌生长，阴性对照管/组澄清且无菌生长，同时无菌检查试验所用的设备环境的微生物监控结果符合无菌检查法的要求，则判定该检品无菌检查符合要求。

（2）若供试品管/组有菌生长，但通过调查发现下列条件中有一条不符合要求则可认为实验无效，可取同量供试品，依法重试检查，若无菌生长，则判定供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

具体条件如下：

● 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；

● 回顾无菌试验过程中，发现有可能引起微生物污染的因素；

● 在阴性对照中观察到微生物生长；

● 供试品管/组中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和无菌操作技术不当引起的.

参考文献

《药品生产质量管理规范》（2010年修订）

《中国药典》2020年版 四部通则1101无菌检查法

《中国药典》2020年版 四部指导原则9203 药品微生物实验室质量管理指导原则

《中国药典》2020年版 四部指导原则9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则

美国药典USP<61> <71>

《中国药典检验标准操作规范》2019年版

FAQs: Microbial Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests | USP