试验方法丨医疗器械生物学评价——体外细胞毒性试验

体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。

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在完成物理和化学性能、加工性能以及外形等有效评价后，医疗器械生产商需要根据ISO或GB/T规定的相关标准进行生物相容性评估，将医疗器械的风险性降至最低。

体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最重要的检测指标之一，也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目；如一次性医用口罩，医用透明质酸钠敷料，牙科种植导板，一次性使用无菌采样拭子，一次性使用手术衣，一次性穿刺微创扩张器套件，医用雾化器等，均需进行细胞毒性试验以对其安全性进行评估。

目的:评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。

意义:可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。（）

GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验

ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices— Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.

 GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物 学试验方法

YY/T 0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价 第2单元 试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法

体外细胞毒性试验具有通用性，可以适用于各种医疗器械和生物材料的评价，试验主要分三类：浸提液试验，直接接触试验和间接接触试验。

选择哪种方法进行体外细胞毒性试验，需根据医疗器械产品的材料，与机体相互作用途径来选择。当一个评价项目可用多种试验方法时，应考虑试验的原理、灵敏性、可选性、可定量性、重现性、试验材料的适用性及局限性等因素进行选择。

例如：

浸提液法适合检测溶出物的毒性；

直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可检测出材料微弱的细胞毒性；

间接接触法中的适合于毒性大的材料检验；

以上各种方法因原理不同，各有特点，应根据试验材料本身理化性质、毒性作用强弱及其用途，正确地选择试验方法。

(移出细胞)

细胞种板

使用胰蛋白酶消化培养瓶内细胞，使贴壁细胞悬浮。

将细胞移入离心管，放入离心机，3000rpm离心3分钟后，去除上清液。

加入培养基配制接种浓度的细胞悬液。

将配制好的细胞悬液接种于96孔板、6孔板或培养皿中，随后放入二氧化碳培养箱中，根据标准要求培养对应时长。

(离心)

样品浸提及换液

无菌操作制备样品，根据浸提比例加入浸提介质。在37℃下，根据实验方案浸提24小时或72小时。同时根据标准准备空白对照、阴性对照、阳性对照。

浸提完成后，根据标准用浸提液更换细胞培养液，具体操作如下。

MTT法:弃去原培养液,空白对照组加入空白对照浸提液,阴性对照组加入阴性对照品浸提液,阳性对照组加入阳性对照品浸提液,供试品组分别加入100uL不同浓度的样品浸提液(100%、75%、50%、25%),换液后放二氧化碳培养箱继续培养24小时。

直接接触法:弃去原培养液,加入2mL新鲜培养液,将制备好的样品轻放于中央细胞层上，随后放入二氧化碳培养箱继续培养24小时。

间接接触法:按标准要求在培养皿中放入空白对照、阴性对照、阳性对照、样品浸提液润湿的滤纸片，二氧化碳培养箱继续培养24小时。

(样品更换培养液)

结果观察

(测定吸光度)

MTT法:培养完成，将试验板置于显微镜下观察细胞形态。观察完成后，弃去浸提液,每孔加入50uL质量浓度为1mg/mL的MTT溶液,继续培养2小时。弃去孔内MTT溶液,加入100uL异丙醇,置振荡器上振荡10分钟,在酶标仪570nm和650nm波长下测定吸光度,计算相对增殖率(RGR),根据标准判定样品是否存在细胞毒性。

直接接触法:加入样品培养24小时后,在显微镜下观察细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等,根据标准判定结果。

间接接触法:加入样品培养24小时后,显微镜下观察细胞形态,测量褪色面积,根据标准判定检验结果。滤膜扩散试验在此步进行染色。

1）产品原材料本身；

2）产品中含有明显的细胞毒性，如带药物球囊导管、带涂层的导管导丝；

3）选择的试验方法是否适合本产品，如凝胶类、膏状类、带颜色液体类产品不适合采用浸提法；灌流器产品，灌流器中的活性炭和吸附树脂会对吸附含血清培养基中的血清的有效营养成分，导致浸提液中的血清成分不足，这类产品可能不适用于用含血清培养基浸提。

4）产品暴露于浸提介质是否改变pH值，如产品加入浸提介质后，颜色从粉色变成黄色等。

5）带预冲液产品的处理；

6）环氧乙烷灭菌后的残留量；

样品细胞毒出现阳性并不意味着不能应用于临床，细胞毒性的结果还应结合其他试验数据，如材料的物理化学表征、产品组成及预期用途等因素进行综合评估，当试验出现毒性结果的时候，可采取进一步评价进行解释，例如：